我优求知网细胞增殖论文篇1
【关键词】骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖
EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells
AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.
Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation
JExpHematol2007;15(3):622-625
目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelialcells,EC）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用来***缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行***具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行***，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞***疾病有一定的指导意义。
动物
昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。
主要试剂和仪器
IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2培养箱购自美国Forma。
小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养
用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。
内皮细胞的形态观察及vWF的检测
培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免***荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。
不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响
取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。
GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定
将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔0.2ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。
生长曲线
纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。
细胞周期的流式细胞术检测
无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。
细胞传代培养
取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。
统计学处理
实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。
结果
细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（***3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。
rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响
小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01）（***4）。
GMCSF对EC细胞周期的影响
运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的***，从而促进了细胞的增殖（***5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.
体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响
***6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。
Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.讨论
国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。
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细胞增殖论文篇2
关键词：细胞因子，生长因子，脑膜瘤
脑膜瘤是颅内仅次于胶质瘤的常见原发肿瘤，占脑肿瘤的10%～15%，几百年来，一直受外科医师的关注，其主要以手术***，但辅助***也极为重要[1,2]。科技论文，脑膜瘤。细胞因子和生长因子通过脑膜瘤的自分泌和旁分泌效应产生，而这些因子经过与脑膜瘤上特异受体相结合，调控脑膜瘤的增殖[3,4]。这些因子的研究为脑膜瘤的辅助***提供了新途径。
一、生长因子及其作用
1、血管内皮生长因子（vascular endotheliargrowth factor,VEGF）又称血管通透因子（vascular permenbility factor,VPF），是1989年由Fferrare等从牛垂体的滤泡星状细胞中提取的1种糖蛋白，是1种高度特异性的血管内皮细胞有丝***原，可通过与VEGF受体(VEGFR)特异性结合，从而刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加，促进新生血管生成，在脑膜瘤的生长和转移中发挥重要作用。其家族有6个成员：VEGF-A（通常所指的VEGF）,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E以及胎盘生长因子[5],均为同源二聚体蛋白，且具有相似的空间结构，分别定位于不同的染色体。目前已发现的VEGF受体（vascular endotheliargrowth factor receptor,VEGFR）有5种，其中有3种属于酪氨酸蛋白激酶受体超家族，VEGF-1（Flt-1）、VEGFR-2(KDR/FIk-1)、VEGFR-3(FLt-4)，不同受体具有各自特异的生物学特性。VEGF主要通过VEGF-1和VEGFR-2在内皮细胞上发挥作用[6]。VEGFR-2在体内外触发细胞内信号转导机制中均发挥作用，为发挥作用的主导受体，可与所有形式的VEGF相互作用[7],其为诱导内皮细胞增殖和分化的主要介质，与VEGFR-1共同完成血管的新生。VEGFR-1能以可溶形式存在，因为对VEGF而言它的胞外部分比VEGFR-2更具有亲和力[8]。VEGF的另外两种受体是Npn-1 和Npn-2，它们是1种非酪氨酸激酶跨膜蛋白，细胞内部分比较短，不能介导Semaphorin的信号转导。Merrill等[9]报到在正常大脑组织中可检测到低水平的VEGF表达，但意义并不清楚。谢尚闹等[10]用免***组化方法检测，发现正常脑膜组织不表达VEGF，而脑膜瘤中均有不同程度的VEGF蛋白表达。科技论文，脑膜瘤。
2、血小板源生长因子（PDGF）: PDGF家族包括PDGF-AA和PDGF-BB及其相应受体包括PDGF-α-R和PDGF-β-R。除PDGF-α-R外，其余成员的mRNA均在脑膜瘤细胞中检出，且在绝大多数脑膜瘤培养上清液中发现PDGF-AA和PDGF-BB。PDGF可刺激脑膜瘤细胞的增殖，外加PDGF（主要是PDGF-BB）以剂量依赖关系促进培养脑膜瘤细胞增殖，且PDGF抗体可显著抑制脑膜瘤培养液提取液所刺激脑膜瘤细胞的增殖[11]。徐广明等[12]研究揭示了PDGF在脑膜瘤生长于发生过程中的作用，表明PDGFB链可以作为反义基因***脑膜瘤的优选靶向。
3、成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowth factor,FGF）:由垂体和下丘脑分泌的多肽，可以促进细胞，特别是内皮细胞增殖的蛋白因子家族，在细胞的生长、分化中起关键作用，与血管的生成，伤口的愈合和胚胎发育有关，对某些祖细胞的分化具有抑制作用。FGF及其相应受体皆在脑膜瘤细胞中表达，且FGF亦以剂量依赖关系促使无血清培养液中脑膜瘤细胞的增殖，故认为FGF参与脑膜瘤细胞自分泌生长刺激环路[13]。姚曙光等[14]研究显示，FGF-1和FGFR-1在正常脑组织和脑膜瘤组织中均有表达，并且在高病理级别组的表达显著强于低病理级别祖，二者与脑膜瘤病理分级密切相关。这提示FGF-1的促有丝***活性可能对脑膜瘤细胞的增殖有重要作用。科技论文，脑膜瘤。
4、胰岛素样生长因子（insulin-like growthfactor,IGF）: IGF包括IGF-I和IGF-II，它们及其相应的受体的mRNA均在脑膜瘤细胞中表达，并在培养的脑膜瘤内检到IGF-I和IGF-II。在正常对照的脑膜瘤中IGF-I及其受体mRNA的存在，这提示IGF-II可能是主要的脑膜瘤生长调控因子。另外。IGF亦以剂量依赖关系刺激脑膜瘤细胞DNA的合成[15]。所以IGF确系脑膜瘤自分泌刺激因子。
5、其他生长因子：表皮生长因子及其受体，脑膜瘤细胞及其微粒体中含有EGF受体，但EGF在脑膜瘤细胞培养上清中仍未检出，故推测其可能以旁分泌方式参与脑膜瘤增殖调控[4].此外，转化生长因子等亦可能参与脑膜瘤的调控。
二、细胞因子及其作用
1、白细胞介素（IL）既往认为IL是淋巴细胞产生的细胞因子，但目前发现很多肿瘤细胞均可分泌IL，其中确定与脑膜瘤有关的IL有以下两种类型。
（1）IL-6:众多实验表明，IL-6为脑膜瘤的自分泌因子。1994年Todo首次在培养细胞中发现IL-6mRNA的存在，并利用放射免***法在其培养上清中检出IL-6[16]。IL-6可促使急性期蛋白合成，血管形成及多种细胞增殖，但其对脑膜瘤的作用尚有争议。Lichtor等采用生物学活性检测却发现，外加IL-6可显著促使培养的脑膜瘤细胞增殖[17]。IL-6通过与细胞表面相应受体结合后刺激gp130胞内部分酪氨酸磷酸化而发挥作用。在不同的组织与细胞中其表现出不同的生物行为，如对大多数肿瘤细胞，IL-6表现出促进增殖作用；但同时IL-6亦抑制少数其它肿瘤的生长。师蔚等[18]研究认为，与IL-6的多效性生物学行为有关，即IL-6本身可能抑制脑膜瘤细胞的增殖，但当其浓度增高到一定程度是却能诱导其它脑膜瘤促增殖细胞因子或受体的表达，从而总体上因IL-6浓度不同而表现出不同效应；亦可能与IL-6在不同亚型脑膜瘤细胞内具体的信号转导机制不同相关，有待于进一步探讨。
（2）IL-1β：是脑膜瘤自分泌增殖抑制因子，Levy采用ELISA法，定量测出脑膜瘤培养上清液中IL-1β的相对浓度，而在正常对照组则尚未检出[4]。外加IL-1β可显著抑制培养的脑膜瘤细胞的增殖[17]这与IL-1β可诱导NK细胞的杀伤活性，从而具有抗肿瘤作用的观点一致。王贵新等[18]研究认为IL-1β与恶性脑膜瘤的发生有关。
（3）其它类型：IL-3为多重集落刺激因子，可促使多种细胞增殖，IL-3对培养脑膜瘤细胞有明显的促增殖效应，推测该作用系IL-3于脑膜瘤细胞表面相应受体结合所致；IL-8为趋化因子的一种，其对某些肿瘤细胞尚表现出增殖效应，本研究表明IL-8在10ng/ml时对脑膜瘤细胞展示最大促增殖效应，但在其它浓度组却并未表现出显著的促增殖效应，故尚不能肯定IL-8对脑膜瘤细胞增殖的促进作用，因体外实验中对某些因子作用的判断应具有剂量依赖关系[19]。
2、肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor,TNF）最初发现这种物质造成肿瘤组织坏死而得名。科技论文，脑膜瘤。根据其产生来源和结构不同，分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化的T细胞产生，又名淋巴毒素，两类TNF基本的生物活性相似，除具有杀伤肿瘤外还有免***调节，参与发热和炎症的发生[20]。王贵新等[18]研究认为TNF-α与恶性脑膜瘤的发生有关。科技论文，脑膜瘤。占世坤等[21]研究脑膜瘤病人术后TNF的表达逐步正常，这与肿瘤切除彻底，瘤周水肿较轻有关。科技论文，脑膜瘤。转移瘤及恶性程度较高的星形细胞瘤患者术后血清中TNF的水平仍持续升高，可以认为TNF可以作为预测肿瘤预后的一项指标，进一步研究肿瘤患者TNF的表达，可以为肿瘤的TNF***提供理论参考。
三、相关因子在脑膜瘤***中的作用
众多学者提出，既然脑膜瘤处在复杂的自分泌和旁分泌生长调控网络中，那么采取某些措施有效地打断其生长刺激环路，则可能会抑制脑膜瘤的增殖[2,3,4]。
1、相关因子拮抗剂Trapidil：Trapidil以剂量依赖关系抑制大多数正常培养脑膜瘤的增殖，同时因为Trapidil具有拮抗PDGF样因子的作用，对外加脑膜瘤培养提取液所刺激脑膜瘤细胞的增殖仍有抑制作用[22]。相关因子拮抗剂Suramin以剂量依赖关系拮抗上述生长因子与其特异性受体结合，抑制脑膜瘤细胞增殖，而且当浓度达100μmol/L时，可使EGF、IGF-I或PDGGF-BB所刺激脑膜瘤细胞完全破坏[23]。
2、Ca²+通道阻滞剂：在培养的脑膜瘤细胞中，当外加Ca通道阻滞剂Verapamin的浓度达1μmol/L时，则可降低EGF、IGF、PDGGF或FGF所刺激脑膜瘤细胞的增殖，但更高浓度不能使抑制效应更明显[24,25]。
随着分子生物学研究的不断进展，为肿瘤的***开辟了一条新的途径，细胞因子与生长因子虽然目前尚未见到在脑膜瘤基因***中的应用，但随着脑膜瘤分子生物学特性及其联合基因***方案的深入研究，脑膜瘤自旁分泌相关因子定会在其基因***中发挥出重要作用。
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细胞增殖论文篇3
方法：不同浓度的皮鳞癌一号方作用于A431细胞24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）显色法检测细胞增殖抑制率。
结果：MTT法显示，随着皮鳞癌一号方作用的时间延长及剂量增加对A431细胞增殖的抑制作用增强，有明显的时间和剂量依赖性，与对照组比较差异有显著性（P
结论：皮鳞癌一号方具有抑制人皮鳞癌A431细胞的增殖及诱导细胞凋亡作用。
关键词：皮鳞癌一号方 A431细胞 细胞周期
【中***分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0002-01
本实验选取的皮鳞癌一号方由遵义医药高等专科学校提供，每ml试液相当于生药2g，以其中所含白头翁中的三萜类皂苷含量作为质量评价标准。本研究通过体外实验，从皮鳞癌A431细胞周期探讨皮鳞癌一号方对SCC的影响。
1 材料
1.1 药物。皮鳞一号方由白头翁、莪术等中药组成，试验品由遵义医药高等专科学校提供，每ml相当于生药2g，以白头翁皂苷B4含量及浸膏收率作为质量控制标准，低温保存备用。
1.2 试剂。高糖的DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司，MTT购自Amresco公司（201105）。
1.3 细胞系。A431细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
2 方法
2.1 细胞培养。A431细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（100U/L）和链霉素（100U/L）的高糖DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃和饱和湿度的培养箱中。
2.2 MTT法测定皮鳞癌一号方对A431细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1.25×105/ml，160μl/孔接种于96孔板。培养24h后，每孔加40μl不同浓度的药物，药物浓度设5个梯度，分别为原药的1/400、1/200、1/100、1/50、1/25。同时设空白调零组（加200μl无血清培养基）、阴性对照组（不加药物）、阳性对照组（5-Fu10μg/ml）。因皮鳞癌一号方有颜色，加设不同浓度颜色对照组。分别培养24h、48h、72h后，弃去上清，加200μl无血清培养基及20μlMTT（5mg/ml），置于二氧化碳培养箱培养4h后，弃上清，加150μlDMSO，振荡10min后，于酶联免***检测仪490nm处测定吸光度值（OD值）。实验重复三次。
细胞生长抑制率（%）=1-（实验组OD-颜色对照组OD/阴性对照组OD-空白调零组OD）×100%。
2.3 统计学方法。采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有计量资料用X±S表示，多组间比较采用单因素方差分析，所有检验均为双侧检验，并以α=0.05作为检验水准。P
3 结果
MTT法测定皮鳞癌一号方对A431细胞的增殖抑制作用。在浓度为1/400，1/200，1/100，1/50，1/25作用于A431细胞24h、48h、72h后，与阴性对照组比较，各浓度组对A431细胞均有增殖抑制作用，且随着药物浓度的增高和作用时间的延长，其对A431细胞的增殖抑制作用愈明显。见表1。
4 讨论
细胞周期是由DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（s期）、DNA合成后期（G2期）、有丝***期（M期）组成。在细胞增殖周期中，G1期、s期、G2期、M期各自起到非常重要的作用。此外，细胞还可以从G1期暂时离开细胞周期，停止有丝***，进入G0期（静止期）。在G0期细胞接受外部信号刺激，决定细胞是进入S期进行DNA复制并完成***发生恶性增殖还是进入相对静止期G0期。如果阻止细胞由G0期进入S期，则肿瘤细胞的无限增殖可以得到控制[2]。
本实验显示：在浓度为1/400，1/200，1/100，1/50，1/25作用于A431细胞24h、48h、72h后，各浓度组对A431细胞均有增殖抑制作用。表明皮鳞癌一号方可以抑制皮鳞癌A431细胞增殖。
参考文献
细胞增殖论文篇4
【关键词】 牛蒡子苷元；人食管癌细胞；细胞增殖；细胞周期
Effects of arctigenin on PCNA expression and cell cycling in human Human Esophageal Cancer Cells MA Hong,de. The First Hospital of Pingdingshan city, Henan 467012,China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ARG on PCNA expression and cell cycling in invitro cultured esophageal cancer ,1 cells Methods EC,1 cells were treated with different concentration ARG.Proliferation of EC,1 cell inhibited by ARG were assessed by MTT.The cell cycle was measured using flow cytometry(FCM)，and the level of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)with immunohistochemistry(IHC).Results ARG could inhibit the growth and significantly suppressed expression of PCNA of EC,1 cells in a dose/time dependent manner(P
【Key words】 Arctigenin；Esophageal cancer ,1；Cell proliferation；Cell cycle
食管癌为常见病，严重威胁人民的健康，其确切发生机制尚未明了，晚期肿瘤仍缺乏有效***手段。近年来发现中药抗肿瘤有一定优势，近来研究表明牛蒡子具有抗恶性肿瘤细胞活性［1］,牛蒡子主要药用成分为牛蒡子苷、牛蒡子苷元(ARG)及牛蒡子酚A、B等，其中起抗肿瘤作用的主要活性成分为ARG［2］。牛蒡子苷元可抑制肝癌细胞增殖［3］, 而对人食管癌细胞的影响报道极少，本文初步观察ARG对体外培养的EC,1 增殖抑制和PCNA表达及细胞周期的影响，为更好地开发牛蒡子的药用价值提供理论与实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 与仪器 EC,1(郑州大学病理实验室提供)，ARG(上海融禾医药科技发展有限公司)；RPMI1640培养液，胎牛血清；免***组化试剂盒；酶标仪、流式细胞仪。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将EC,1接种于RPMI1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U /ml链霉素)，于37℃，5%CO2培养箱中培养。2~3 d传代后，取生长对数期细胞用于实验。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期EC,1细胞常规消化，用RPMI,1640配成单细胞悬液，以每孔104～105个细胞接种于96孔培养板中，常规培养24 h细胞大部分已贴壁，吸出原培养液，实验组加用含不同浓度ARG的培养液，使其终浓度分别为2.5，5，10 mg/L；对照组加培养液。每组设4个平行孔，继续培养48 h后，加入MIT溶液，继续孵育4 h，加入DMSO，振荡，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，测定各孔光吸收值，计算生长抑制率按以下公式：
细胞生长抑制率(％)=［对照组OD均值,实验组OD均值/对照组OD均值］×100％
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 取对数生长期细胞，常规制成单细胞悬液，以1.25×105／ml密度接种于培养瓶中，24 h后加入各浓度ARG (2.5，5，10 mg/L)培养24 h，每组设4个平行孔，收集细胞移入离心管中，1000 r／min离心5min，用PBS溶液清洗一次，在离心管中留约0.5 ml PBS，加入70％冰乙醇5 ml混匀固定，4℃放置48 h以上。检测时，离心离去乙醇，PBS清洗一次，在离心管中留1 ml PBS，加入Rnase酶，室温放置30 min。再用50 μg／ml的碘化丙啶(PI)染色后，用流式细胞仪分析细胞周期。
1.2.4 免***细胞化学检测增殖细胞核抗原 将传代的EC,1以2×105/ml接种12孔培养板，每孔1 ml，每组4复孔,作细胞爬片。细胞生长至80%以上融合度时，加入含0.4%血清的培养液行同步化处理24 h，按上述分组加入不同浓度ARG后继续培养24 h。将培养板孔中的盖玻片取出，PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛固定10 min，按SP试剂盒操作方法进行免***细胞化学PCNA检测，DAB显色，同时用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：胞核呈棕黄色为阳性,并对染色后的细胞片进行显微镜下观察， IDA,2000数码显微***像分析系统对免***组织化学染色切片进行***像分析，以平均吸光度半定量PCNA表达的强度。
1.2.5 所得数据用SPSS 10.0统计软件处理，多样本均数采用单因素方差分析，以P
2 结果
2.1 MTT法检测细胞增殖抑制率 ARG在 2.5~10 mg/L浓度范围内对EC,1细胞的增殖抑制作用随着药物浓度逐渐增强，与对照组差异有统计学意义P
2.2 流式细胞仪检测EC,1细胞周期 不同浓度ARG组G0/G1期细胞百分率较对照组显著增加，S期细胞百分率显著降低。见表2。
2.3 牛蒡子苷元对EC,1内PCNA表达的影响 免***细胞化学染色显示：对照组胞核着色最深，呈棕黄色，实验组随着ARG用量的增加胞核着色逐渐减弱。***像分析结果显示: 5 mg/L和10 mg/L ARG组平均吸光度较对照组明显减低(P
3 讨论
肿瘤细胞具有快速无限增殖能力，抑制肿瘤细胞增殖已成抗肿瘤***的热点，近来有文献报道牛蒡子具有抗恶性肿瘤细胞活性［1］,牛蒡子主要药用成分为牛蒡子苷、牛蒡子苷元(ARG)及牛蒡子酚A、B等，其中起抗肿瘤作用的主要活性成分为ARG［2，3］。本文初步观察ARG对体外培养的EC,1 增殖抑制和PCNA表达及细胞周期的影响。
MTT实验证实ARG在 2.5~10 mg/L浓度范围内可抑制EC,1细胞的增殖，其抑制作用随着药物浓度逐渐增强。PCNA又称细胞周期蛋白，是真核细胞DNA合成时所必需的一种36KD的酸性白，主要在增殖细胞中合成和表达，在细胞周期调控方面发挥着重要作用［4］，并可作为细胞增殖的标记［5］。众多研究表明，PCNA几乎在所有的恶性肿瘤中均有表达，抑制PCNA的表达可抑制癌细胞的克隆形成能力。实验结果显示不同浓度ARG组平均吸光度较对照组均减低，其中5 mg/L和10 mg/L ARG组平均吸光度较对照组明显减低，提示ARG可明显抑制EC,1内PCNA表达。恶性肿瘤的无限制增殖与细胞增殖周期的失控有关［6］，细胞的增殖是通过细胞周期的运行来实现的，近年来对细胞周期的研究表明：细胞周期调控是在各期的控制点上进行的，细胞周期中存在两个重要的调控点：G1/S和G2/M期调控点，只要G1期内的正调节因子累积达到一定程度，周期越过G1/S交界点，以后细胞就不再依赖于细胞外促生长因子而顺序完成整个细胞周期，因而G1/S调控点是影响细胞周期的关键，G1S的转换决定了细胞继续增殖还是停滞或死亡。流式细胞仪分析证实不同浓度ARG组G0/G1期细胞百分率较对照组显著增加，S期细胞百分率显著降低，提示ARG抑制EC,1增殖的机制是使G1期细胞进入S期发生阻滞，从而抑制了EC,1细胞的增殖活性。
因此，ARG抑制EC,1细胞增殖可能与抑制EC,1内PCNA表达及G1S的转换有关，这为ARG作为潜在的抗肿瘤药物提供了实验依据，其具体的机制还有待于更深入的研究。
参 考 文 献
［1］ Matsumoto T， Hosono,Nishiyama K， Yamada H. Antiproliferative and apoptotic effects of butyrolactone lignans from Arctium lappa on leukemic cells. Planta Med，2006，72：276,278.
［2］ Takasaki M，Konoshima T，Komatsu K，et al. Antitumor,promoting activity of lignans from the aerial part of Saus sureamedusa. Cancer Lett,2000，158(1)：53,59.
［3］ 郑国灿.牛蒡子提取液的抗癌性研究.东南大学学报(医学版)，2003，22(5)：319,322.
［4］ Paunesku T, MittalS, proticM, et al.Prolixferation Proliferating cell nuclear antigen: ringmaster of the genome. Int J Radiat Biol, 2001,77:1007,1120.
细胞增殖论文篇5
【关键词】 脂多糖；α干扰素；U937细胞；增殖；凋亡
作者单位：510800 南方医科大学附属花都医院肿瘤科 α干扰素(IFNα)能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，能够增加NK细胞和其他一些活性免***细胞功能，有较强的抗肿瘤活性，其发挥抗肿瘤作用的机制是通过直接抑制肿瘤细胞的增殖与分化，目前IFNα在临床上已被广泛用于血液系统肿瘤的***［1］。Toll样受体为介导天然免***反应并触发或桥接适应性免***的模式识别的一类受体，这类受体在U937细胞中表达。作为Toll样受体的主要外源性配体之一的内毒素脂多糖(LPS)，可与Toll样受体结合后通过信号转导的级联效应产生抑制U937的增殖［2］。本文旨在研究LPS在体外是否具有增强IFNα抑制白血病细胞株U937细胞增殖效应和机制。为TLR配体或其激动剂协同佐剂IFNα免******白血病提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料 胎牛血清(FBS)(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司，批号：100413)；二甲亚砜(DMSO)溶液、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(北京SABC公司产品)；EL301型酶标仪(美国BioTek公司)；人白血病细胞株U937细胞自购进后复苏使用。
12 方法
121 U937细胞增殖抑制率的测定 人白血病细胞株U937细胞常规离心弃上清复苏，复苏后的细胞在加热灭活的10%FBS及100 μg/ml链霉素、100 Μ/ml青霉素的RPMI1640的培养基中，置于37℃、湿度饱和及5%的CO2孵箱中培养，平均每3天对培养基进行更换并传代一次。依据处理U937细胞的药物不同对实验进行分组，实验组：A组(单用IFNα 01 μg/ml)、B组(单用LPS 01 μg/ml)，C组(两药等剂量合用)；另设空白对照组。经药物处理后的U937细胞，混匀后，移取100 μl至96孔培养板中，细胞浓度约为5×105 ml，每组重复8孔，最终每孔体积为02 ml。置37℃、湿度饱和及5%的CO2孵箱中培养；培养液3 d更换一次。于培养终止前4 h每孔中加入20 μL MTT(5 mg/ml)，4 h后离心(3 000 rpm?min，5 min)，将上清弃去，然后每孔加入DMSO 150 μL以终止培养。使用酶联免***检测仪测定其吸光度，以此计算细胞增殖抑制率〔细胞增殖抑制率(%)=(l实验组吸光度/对照组吸光度)×100%〕。
122 U937细胞凋亡率的检测 100 μL人白血病细胞株U937细胞置于含10%FBS的RPMI1640培养基中培养过夜，细胞密度调节至5×106/ml，Binding缓冲液洗涤一次，另取100 μL Binding缓冲液重悬，移取5 μL AnnexinVFITC加入，置暗处孵育20 min，移取10 μL浓度为1 mg/ml的AnnexinV/碘化丙锭，室温下暗处孵育20 min，Binding缓冲液洗涤后重悬，立即检测，获取参数并进行数据分析。
13 统计学方法 所有数据录入Excel中初步处理后，采用SPSS 170统计学软件包进行数据处理，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P
2 结果
各组给予不同药物与U937细胞作用2 d后，与对照组比较，各实验组的抑制率(%)和凋亡率(%)均显著升高(P
表1 IFNα和/或LPS对U937细胞增值的抑制率和
细胞凋亡率的影响(x±s)
组别 抑制率(%) 凋亡率(%)
A组 041±005* 036±003*
实验组 B组 033±001* 030±002*
C组 072±006*# 063±005*#
对照组 006±002 007±004
注：*与对照组比，各实验组均有统计学意义(P
3 讨论
急性白血病的发生和发展比较复杂，具有多阶段、多步骤、多基因的特点。IFNα抗肿瘤的活性较强，临床上已广泛应用于恶性血液系统肿瘤***并有较好疗效［3］。其发挥抗肿瘤的效应的主要机制是调节细胞免***活性或抑制肿瘤细胞的增殖［4］。LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成成分，其对应的受体是Toll样受体8，通过激动或抑制该受体在白血病细胞株U937的表达而达到干预的作用［5］。本实验结果显示，IFNα或LPS对U937细胞的增殖率和凋亡率均有明显的升高作用，而等剂量合用后这一作用显著增强。为佐剂IFNα联合Toll样受体配体或其激动剂免******白血病提供了新的思路。
参 考 文 献
［1］ 熊芳, 王兴兵, 张佳华, 等 Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究.中国实验血液学杂志, 2007, 15(3): 449452.
［2］ Huang B, Zhao J, Unkeless JC, et al TLR signaling by tumor and immune cells: a double edged sword. Oncogene, 2008, 27(2): 218232.
［3］ 王晓桃, 林文远, 陈蓓莉, 等 α干扰素联合脂多糖对白血病细胞株U937细胞周期的影响及其机制研究. 中国全科医学, 2011, 14(10 c): 34573459.
细胞增殖论文篇6
关键词：***癌;中医辨证;DNA倍体;S期细胞比例;Ki-67
中***分类号：R737.9文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)05-0907-03
Study of Relationship between Syndrome Pattern of Traditional Chinese Medicine and Proliferative Factors of Breast Cancer
SONG Aili,YIN Yukun
(Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan 250011,Shandong,China)
Abstract:Objective: A study was conducted to find the relationship between the syndrome pattern of traditional Chinese medicine and proliferative factors of breast cancer such as DNA haploid,S phase cell percentage and Ki-67. Methods：Choose 160 patients who suffered breast cancer primarily to group into different syndromes. Detect the DNA haploids,S phase cell percentage and Ki-67 expression. Then chisquare inspection. Results: Through detecting, heteroploid percentage,S phase cell percentage and Ki-67 positive expression of the patient who suffered breast cancer grouped in the zhengqi-weak-evil-strong type is the higher than the the other two typies. Through chisquare inspection there is markedness disparity among them（P
Keywords:breast cancer；differentiation；DNA haploid；S phase cell percentage；Ki-67
***癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，已位居女性恶性肿瘤发病率之首，严重危害广大妇女的健康。中医的辨证
论治在其综合***中起着重要作用。***癌的DNA倍体情况、S期细胞比例及Ki-67的表达是***癌常用的反映肿瘤增殖的指标，可以提示预后。研究***癌术前中医辨证与肿瘤增殖因子的关系，可反映***癌各中医证型的预后特点，也是肿瘤***的切入点。
1 资料与方法
1.1临床资料
来源于山东中医药大学附属医院***科病房部2003年1月-2007年1月收治的原发***癌术前患者，共160例，均为女性，年龄为24～84岁，平均年龄（47.74±11.14）岁。详细采集患者一般情况及症状、体征等信息。
1.2中医辨证
主要根据国家中医药管理局颁布的《中医病症诊断疗效标准》（ZY/T001.2－94）作为辨证标准，综合***癌患者术前的临床表现，对其进行中医辨证。辨证结果见表1。
1.3指标检测取山东中医药大学附院***科手术切除女性***经病理学确诊为***癌，标本160例，检测DNA倍体及S期细胞比例，其中40例进行Ki-67检测。标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,制成4μm薄切片,进行常规HE、免***组织化学染色及DNA***象分析的检测。
1.4统计方法采用SPSS13.0 for windows统计软件进行χ2检验,P
2结 果
2.1***癌术前中医辨证与DNA倍体的相关性 结果见表2。
3讨 论
随着对***癌的研究，人们认识到***癌的发生发展和转归是多因素、多机制共同作用的结果，对***癌生物学行为的认识也不断深入。***癌的DNA倍体情况、S期细胞比例及Ki-67的表达是***癌常用的反映肿瘤增殖的指标，可以提示预后。
恶性肿瘤的重要特征之一就是细胞无限制的恶性生长，细胞核增大，核内染色质增多，其实质是细胞核内DNA 的不断复制。细胞DNA异倍体的出现代表了核染色质数量和结构发生的改变，这种改变不但加速了细胞***增殖，同时导致细胞内特异性多肽白的合成失败,使细胞不能从增殖状态转变为分化状态。研究发现DNA倍体也与肿瘤的分期（大小、淋巴结状况）有关，异倍体更多见于体积大、淋巴结转移率高的肿瘤中。细胞DNA倍体反映细胞生长及分化状态,其倍体的测定对判断肿瘤性质、预后具有重要意义[1] 。
S期细胞比例反映了肿瘤的增殖活性，其数值与肿瘤细胞的倍体相关：二倍体较异倍体的S期细胞比例低。许多文献报道，高S期细胞比例***癌的复发率明显增高。此外还有报道测定细胞增殖率有助于预测肿瘤对化疗及内分泌***的反应性。有些作者认为***后异倍体肿瘤的退缩率较低。DNA倍体联合S期细胞比例作为预后评估指标与腋淋巴结阳性及阴性患者的复发与生存情况有密切的关系[2]。
Ki-67 是目前公认的肿瘤细胞增殖的特异性指标,是由Hodgkinps 淋巴瘤所产生的L428 细胞系的粗制核部的鼠单克隆抗体, 其高表达与肿瘤患者的不良预后相关[3-4]，由Gerdes 等首先报道[5-6] 。研究表明Ki-67 表达能可靠而迅速地反映恶性肿瘤增殖率,与多种恶性肿瘤的发展、转移、预后有关。
此外还有报道检测肿瘤细胞增殖率有助于预测肿瘤对化疗及内分泌***的反应性，如有些作者认为***后异倍体肿瘤的退缩率较低。以上提示，这些肿瘤增殖因子既反映***癌的预后，又是肿瘤***的切入点。
中医药的***手段在***癌的综合***中有重要的地位。大量临床和实验研究表明，***癌患者配合中医药辨证论治，应用扶正与祛邪中药，可调整机体阴阳、气血、脏腑和经络功能，改善机体物质代谢，增强机体免***功能和抗病力，减轻放化疗毒副反应，提高手术切除率及放化疗成功率。中医药疗法对减少复发和转移，提高***癌患者的生存率和生存质量，延长生存期限具有重要作用[7]。辨证论治是中医药***的核心内容，中医***疾病，选药要根据辨证的结果，如果从现代客观的肿瘤发展机制角度来反映***癌证候的特点，对于指导中医各证型的预后及对证***可提供更切实的依据和更广阔的思路。
本文对160例***癌术前患者进行中医辨证，手术标本检测肿瘤细胞DNA倍体、S期细胞比例，其中40例检测Ki-67表达情况，分析之间相关性，探讨中医辨证在判断***癌预后中的价值，从肿瘤增殖角度观察***癌中医证候特点，从而为进一步的中医***、研究***癌提供新的思路和切入点。
本研究发现***癌术前辨证与DNA倍体、S期细胞比例相关。***癌患者术前辨证为正虚毒炽者DNA倍体异倍体、Ki-67阳性出现率最高（69.4％，94.4％），冲任失调组次之（41.0％，58.3％），肝郁痰凝组最低（23.5％，12.5％），经统计学处理，3组之间有显著差异（P
研究表明***癌术前中医辨证与肿瘤增殖因子DNA倍体、S期细胞比例及Ki-67表达确有相关性，反映出随着中医证型为肝瘀痰凝证、冲任失调证到正虚毒炽证的不同，肿瘤的增殖能力依次增强，预后也更差，从而从肿瘤增殖角度反映了***癌证候的预后特点。
目前中医药******癌已经越来越受到重视，而中医用药需要依据辨证的结果。判断中医各证型与***癌增殖因子的相关性，有助于指导对各证型预后的判断，针对性的选择中医***的方法及用药，从而从生物学角度来辅助指导***癌的中医***。
中医******癌的另一热点是通过中药来阻断、逆转***癌的进展，而本研究的结果显示了***癌术前辨证与肿瘤增殖因子有相关性，随着证候的发展，肿瘤细胞的增殖能力进一步增强。从而提示，通过早期对证***，减缓、阻断、逆转***癌的证候演变，达到减缓肿瘤增殖的可能，进而为下一步的研究开阔了思路。
参考文献
［1］ FilipeM I, Rosa J, Fimals AS, et al. Is DNA p loidy and p roliferative activity of p rognostic value in advanced gastric carcinoma[J].Hum Pathol，1991, 22: 373-378.
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[5] Williams GH,Romanowski P,Morris L,et al.Improved cervical smear assessment using antibodies against proteins that regulate DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(25):14932214937.
细胞增殖论文篇7
[关键词]静态牵张应力;兔鼻软骨细胞;增殖活性;流式细胞术
[中***分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)08-1152-04
Clinical Significance of tension force on proliferation of rabbit nasal chondrocytes in vitro
BAI Ming-hai1, WU Han-jiang2,ZHANG Ting-ting3,JIANG Cui-chang1,LING Tian-you2
(1.Department of Orthodontics,Changsha Stomatology Hospital, Changsha 410005,Hunan,China;2.Department of Stomatology,Xiangya Second Hospital,Central South University,Changsha 410011,Hunan,China;3.Department of Laboratory,Xiangya Second Hospital,Central South University,Changsha 410011,Hunan,China)
Abstract:ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the effects of tension force on proliferation of rabbit nasalchondrocytes in vitro and its clinical significance.Materials and MethodsThe fourth-passage chondrocytes were harvested from the nose of neonatal and 6-week-old rabbits. A continuous static tension force was applied on the cells in vitro using a cellular static tension force device, and the proliferation of nasal chondrocytes were examined using a flow cytometry. The experimental group were divided into seven groups under continuous 5 kPa static distraction for 0 to 12 hours. ResultsThe results showed that the proliferation of nasal chondrocytes was promoted as the application time of 5kPa static tension force was prolonged (0～10 hours).The maximal proliferationappeared, when the nasal chondrocytes were cultured under 5kPa continuous static tension force for 10 hours (P
Key words:tension force;rabbit nasal chondrocytes;proliferation;flow cytometry
在唇腭裂患者序列***过程中,对唇腭裂伴发鼻畸形的处理一直是个难点。有学者提出[2-4],患儿出生后立即牵张鼻软骨术前正畸,延长短小鼻小柱,可复位移位的鼻翼软骨,纠正鼻尖塌陷,大大降低手术矫治唇腭裂伴发鼻畸形的难度,使唇裂修复与鼻畸形矫治能同期完成,获良好远期整复效果。但鼻软骨牵张术前正畸矫治唇腭裂伴发鼻畸形中软骨细胞牵张力的生物力学机制如何,国内外尚未见相关基础理论研究;国外学者已采用鼻软骨牵张方法矫治新生患儿鼻畸形,但这种鼻软骨牵张方法能否用于矫治更大年龄唇腭裂患儿鼻畸形,都是值得探讨的问题。
本研究旨在通过观察体外培养兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性的变化,探讨静态牵张应力促进鼻软骨生长的可行性,为临床应用鼻软骨牵张术前正畸矫治唇腭裂伴发鼻畸形提供实验依据,进而探索一条矫治唇腭裂伴发鼻畸形新途径。
1材料和方法
1.1 实验仪器:SFEG AIR TECH超净工作台(苏州,苏净集团),Forma Scientific CO2培养箱(美国),OLYMPUS IX 50 相差显微镜(Olympus公司,日本),MSE MISTRAL 1000水平式低温离心机(哈尔滨东联电子公司)。
1.2 实验材料:Ⅱ型胶原蛋白酶(上海生工公司),胰蛋白酶(Sigma公司,美国),DME M培养基(Sigma公司,美国), 胎牛血清(杭州四季青生物公司),聚苯乙烯一次性培养瓶,皿,板(Falcon公司,美国),新生及六周龄纯种新西兰白兔(中南大学湘雅二医院动物室提供),医用硅胶膜(化工部有机硅中心,成都),医用耐酸不锈钢及常规细胞培养实验器械等。
1.3 细胞膜牵张力施加装置(四川大学生物力学研究所提供):细胞膜式牵张力施加装置如***1所示。将体外培养的细胞种植于硅胶膜上,通过硅胶膜密闭隔开细胞培养小室与液压小室,利用液体静张力使膜发生弹性形变,贴附于膜上的细胞受到相应牵张力。通过调节液体的液面差,可以较准确控制实验所需的牵张力。
1.4 实验方法
1.4.1新西兰白兔兔鼻软骨细胞培养及鉴定:兔鼻软骨原代细胞传代培养到第4代,每天常规在倒置相差显微镜下观察兔鼻软骨细胞在培养瓶及硅胶膜上的培养性状和形态学特点。采用甲苯胺蓝染色和免***组化检测Ⅱ型胶原表达方法鉴定兔鼻软骨细胞。
1.4.2培养小室及硅胶膜处理:本实验所用硅胶膜厚约0.2mm,直径38mm,将硅胶膜放入75%酒精浸泡24h,去除可能的其他化学成分,三蒸水反复漂洗后浸泡12h,组装不锈钢整体培养小室,整体高温,高压(121℃,0.1 MPa,25min)灭菌。
1.4.3细胞力学实验前准备:将第3代培养的兔鼻软骨细胞传代,0.25%胰酶消化后,按2×105个/孔的密度接种于培养膜上,培养膜上预先加入5%胎牛血清DMEM培养液2ml,于 CO2培养箱内(37℃,含95%空气,5% CO2)培养,培养15h后,用PBS液洗3次,加入15%胎牛血清的DMEM培养液,依据相关实验方案进行实验。
1.4.4实验方案:分别测定第4代体外培养新生及六周龄新西兰白兔鼻软骨细胞(70份样本)在5kPa牵张力作用下培养(15%胎牛血清浓度)0,2,4,6,8,10,12h后DNA含量(以0h为对照)(流式细胞仪)。样本量均为5个。
1.5 流式细胞仪检测:在培养膜加入适量0.25%胰酶,室温下消化15s 左右,4℃ PBS漂洗,离心(4 000r/min,4min 各一次),收集鼻软骨细胞;5ml 80%酒精固定保存于塑料离心管,流式细胞仪检测细胞增殖活性(北京鼎国生物公司)。细胞增殖活性以增殖指数(proliferative index,PI)表示,先检测各细胞周期表,然后按以下公式计算:
1.6统计分析:所有数据输入SPSS 13.0软件包进行组间方差分析。
2结果
2.1 体外培养兔鼻软骨细胞培养和鉴定:硅胶膜表面生长的软骨细胞形态正常,具有典型多角样细胞形态特征,并可见正在***增殖的细胞;静态牵张应力刺激培养下硅胶膜上兔鼻软骨细胞呈多角形的伸展状态,细胞整体形态被拉伸。所培养的细胞经甲苯胺蓝染色和免***组化检测Ⅱ型胶原表达结果为阳性,鉴定为软骨细胞(***2)。
2.2 新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在静态牵张应力作用下增殖活性变化:从表1可见,0～10h内5kPa静态牵张应力组软骨细胞增殖指数随着牵张力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于10h处,12h处PI指数下降;静态牵张应力对体外培养的新生及6周龄兔兔鼻软骨细胞均有促增殖作用,但对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。
3讨论
3.1 选择静态牵张应力值的依据:郭欣[5]等报道,膜式细胞牵张力施加装置符合体外细胞应力加载的要求,操作方便,性能可靠,可长时间稳定运行,已在多种细胞体外加力实验中得到应用。本课题的预实验观察到在5kPa荷载下硅胶膜变形率分别为8%,且在这种张应力条件下兔鼻软骨细胞始终贴壁生长,体外培养鼻软骨细胞增殖活性均有改变,因此根据膜式细胞牵张力施加装置特性及预实验结果,初步选用5kPa大小的牵张力。
3.2 体外培养兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下的增殖活性变化及其临床意义:有学者从细胞分子水平对软骨细胞做了相关研究,结果表明:不同大小牵张力作用下均可导致软骨细胞的增殖活性变化[6-8]。本实验发现牵张力实验组与对照组有显著统计学差异(P
3.3 体外培养不同年龄的兔鼻软骨细胞在5kPa静态牵张应力作用下的增殖活性变化及其临床意义:1984年,Matsuo[1]等报道,耳廓软骨畸形患儿在出生后立即行软骨牵张矫治,可使耳软骨的面积和体积增加,获得了良好远期效果。Matsuo认为,在围产期阶段,母亲体内雌激素含量上升,相应导致胎儿细胞内透明质酸含量增加,透明质酸通过破坏细胞间质成份降低软骨,韧带和相关组织的弹性程度,使其柔软而容易塑形。而出生6周后婴儿体内雌激素水平开始下降,软骨变得富有弹性而不易塑形。因此认为唇腭裂伴发鼻畸形的牵张矫治应在出生后立即进行。20世纪90年代,在Matsuo研究基础上,Cuting,Grayson,Maull[2-4]等报道唇裂鼻一期修复术前应用牙槽突复位鼻畸形矫治器(Nasoalveolar Molding Plate,NAM)牵张鼻软骨,采用非手术鼻软骨牵张方法矫治唇腭裂伴发鼻畸形取得了良好效果(牵张装置示意***见***3、4)。本研究从体外细胞培养角度验证了鼻软骨牵张术前正畸方法矫治唇腭裂伴发鼻畸形的可行性。本研究结果表明:5kPa牵张力对不同年龄兔鼻软骨细胞的增殖活性变化的影响不同,牵张力对新生兔体外培养兔鼻软骨细胞的促增殖作用更为显著。我们推测可能是由于新生兔兔鼻软骨细胞较6周龄兔兔鼻软骨细胞在牵张力刺激下产生的具有促进细胞增殖作用的细胞因子的能力更强,所以对牵张力等刺激因素更为敏感有关,其机制尚需进一步深入研究。
本研究结果还表明,牵张力无论是对新生兔还是6周龄兔体外培养兔鼻软骨细胞均有促增殖作用。本实验是运用体外细胞培养技术分析单一因素对细胞增殖活性影响,不受体内雌激素含量高低影响,无法用Matsuo等学说解释;资料表明:六周龄新西兰白兔年龄相当于人类1岁左右儿童年龄[9],故牵张力对新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性均有影响这一结果提示我们:在临床上鼻软骨牵张方法除适用于矫治新生唇腭裂患儿的鼻畸形外,也可能用于矫治1岁左右甚至更大年龄患儿的鼻畸形,这就为临床上采用鼻软骨牵张技术矫治唇腭裂伴发鼻畸形提出了一条新的思路,扩大了适应证范围,可能具有潜在临床应用价值。
[参考文献]
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细胞增殖论文篇8
慢性粒细胞白血病（CML）是一种造血干细胞的恶性克隆及骨质增殖类疾病，主要特点是包含已成熟及未成熟各阶段的外周血粒细胞过多生成，血象及骨髓象是CML诊断的重要参考依据，CML患者血象显示中WBC升高明显，RBC和Hb初期阶段正常，而加速、急变时期会出现骤降情况，PLT与慢性期为正常范围或稍微升高，但急变期也会出现骤降情况，骨髓象在急变期时，原粒与早期幼粒细胞则超过30%，同时PH染色体呈现阳性，白细胞不断上升，呈现典型血象及骨髓象变化，患者NAP中性粒细胞的活性逐步减弱或呈现阴性、PH染色体为阳性，同时BCR-ABL基因融合，由此可以确定为CML的诊断结果。
关键词：慢性粒细胞白血病；细胞形态学；血液学；进展研究
【中***分类号】
R249 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0258-01
CML是一种造血干细胞的恶性克隆及骨质增殖类疾病[[1]，病理为慢性期-加速期-急变期。该病发病率约为万分之一，占成年人白血病比重的15-20%左右，可发病于任何年龄段，其中40-50岁为高发人群，男性发病率略高于女性[2]。本文以血液检验等相关资料作为阐述对象，对CML血细胞形态展开综述。
1 CML的检测诊断方法
CML检测诊断除了对患者询问病史以外，还需白细胞分类记数、外周血细胞记数，骨髓穿刺法涂版记数、生化检查、骨髓活检、荧光原位杂交、染色体本核型分析及BCR/ABL基因检测等诊断方法。
2 CML诊断和鉴别诊断
2.1 血象
2.1.1 白细胞计数量明显升高，初期为（10-50）×109・L-1，最高可达到1000×109・L-1，同时中性粒细胞迅速增殖，并呈现出各个阶段的粒细胞，主要包含15-40左右的中幼粒细胞及20-40%的晚期幼粒细胞，早幼粒细胞和原始粒细胞在5%以下，加速及急变期原细胞开始增殖，分叶与杆状核粒细胞也同时升高，嗜碱粒细胞可升高到10-20%，嗜酸粒细胞则升到5-10%，NAP活性减弱或呈阴性，此外少数***型CML病患的单核细胞可增殖10-20%，原始及幼稚单核仅为少数，多数为成熟的单核细胞，随着病情不断发展，原始粒细胞会持续增殖，加速期超过10%，急变期可超过20%。
2.1.2 血红蛋白与红细胞早期多为正常，少数稍微下降，但随病情进展，初期多数患者的Hb为90-100g/L，主要为正细胞及正色素贫血，分类偶见核红细胞、多染红细胞及点彩红细胞，如果患者Hb、RBC突然降低，则表明可能存在急变。
2.1.3 初诊病例中血小板增殖通常为35-50%，仅有小部分患者的PLT为正常范围或稍微增殖，此外PLT形态正常，但会出现中等以及较大的血小板出现，极个别患者外周血内生成巨核细胞，如果PLT不断增殖突然降低，或者持续偏低突然增殖都表明存在急变的可能，具体见下表。
2.2 骨髓象
2.2.1 粒细胞系统比率迅速增殖，其中以中幼、晚幼及中性杆状细胞为主要增殖对象，原始粒细胞小于10%，大部分幼粒细胞会伴有核浆发育异常，并很可能出现***相。嗜酸及嗜碱粒细胞开始增殖，嗜酸粒细胞可达5%-15%间，嗜碱粒细胞可达3%-10%间，并多为成熟粒细胞。此外淋巴细胞与单核细胞的比例降低，少部分患者的粒系病态造血显著明显，嗜酸及嗜碱粒细胞比例正常，而单核细胞比例增加，且形态异常。
2.2.2 红细胞系统在早期仍然增殖，但低于粒细胞，晚期红细胞系统因受到抑制而发生降低。
2.2.3 巨核细胞明显增多，超过300-1200个/片。同时血小板大多呈堆或片状。
2.2.4 NAP活性减弱或呈阴性，***过程中可有效增加其活性，而复发时再次降低。
2.3 骨髓活检：
加速期阶段原粒及早幼粒细胞的数值大约处于慢性期和急变期之间，急变期阶段原粒及早幼粒细胞超过30%，具体见表2。
3 讨论
CML是一种造血干细胞的恶性克隆及骨质增殖类疾病[1]。主要以包含已成熟及未成熟各阶段的外周血粒细胞过多生成为主要临床特点，这其中嗜酸粒细胞与嗜碱粒细胞增殖比重约为95%，***型CML在4%-5%间。集结在患者骨髓中的CML不但会阻碍正常造血功能，还会通过血液扩散至全身，同时伴有贫血、感染、出血以及器官浸润等症状产生[3]。临床中主要以血象及骨髓象是CML诊断的重要参考依据，CML患者血象显示中WBC升高明显，RBC和Hb初期阶段正常，而加速、急变时期会出现骤降情况，PLT与慢性期为正常范围或稍微升高，但急变期也会出现骤降情况，骨髓象在急变期时，原粒与早期幼粒细胞则超过30%，同时PH染色体呈现阳性，白细胞不断上升，呈现典型血象及骨髓象变化，患者NAP中性粒细胞的活性逐步减弱或呈现阴性、PH染色体为阳性，同时BCR-ABL基因融合，由此可以确定为CML的诊断结果。总而言之，血象及骨髓象作为CML诊断的主要参考依据具有重要临床意义。
参考文献
[1] 葛群芳，陈建斌，杨泽松，等.慢性粒细胞自血病合并自身免***性溶血性贫血1例分析[J].中国误诊学杂志，2012， 8（12）：1747.
细胞增殖论文篇9
【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类
Influence of bile acid on proliferation and ERK expression in human normal esophageal epithelial cells
【Abstract】 AIM: To observe the influence of bile acid on cell proliferation and the expression of extracellular signalregulated protein kinase (ERK) in human normal esophageal epithelial cells in vitro. METHODS: Human normal esophageal epithelial cells cultured in vitro were exposed to media containing 6 different kinds of bile acids (250 μmol/L) respectively for 360 min， in comparison with the control group (in normal media without bile acid). Cell proliferation was assessed using MTT and flow cytometry. The expression of phosphorylated ERK1/2 protein was determined by the immunoblotting technique. RESULTS: Bile acidexposed (312 min) esophageal epithelial cells exhibited a significant increase in proliferation， especially in S phase of the cell cycle， and the level of phosphorylated ERK1/2 protein. While the bile acidexposed period exceeded 20 min， esophageal epithelial cells exhibited a degression in proliferation and proportion on S phase of the cell cycle. CONCLUSION: The brief exposure in bile acid increases the proliferation in human normal esophageal epithelial cells by activating the ERK pathway.
【Keywords】 cholic acid; esophagus/cytology; cell proliferation; extracellular signalregulated MAP kinases
【摘要】目的： 观察胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响. 方法： 体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，分别在含有6种不同胆酸（250 μmol/L）的培养液中培养3~60 min，并设对照（培养液不含胆酸）进行比较. 采用MTT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态. 免***印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达. 结果： 胆酸的短时间（3~12 min）作用使细胞增殖比大于1，S期细胞比率升高，磷酸化ERK1/2蛋白表达增加. 当作用时间大于20 min时，细胞增殖比和S期细胞比率下降. 结论： 胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关.
【关键词】 胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类
0引言
近年来随着国内外食管反流性疾病的增加，对十二指肠胃食管反流的研究日渐深入. 反流物中的胆汁主要由胆酸组成，胆酸在反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的发生发展过程中起着重要作用［1］. 目前胆酸对食管细胞作用的信号传导机制研究尚少. 丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase， MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signalregulated protein kinase， ERK)是MAPK通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关［2］. 为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.
1材料和方法
1.1材料人角朊细胞培养液KSFM（keratinocyte serumfree medium）及牛垂体提取物（BPE），重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco公司）. 甘氨胆酸钠(GC)，甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)，牛磺胆酸钠(TC)，牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC)，胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma公司），分别溶于KSFM制成250 μmol/L的胆酸溶液. 抗人细胞角蛋白14单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）. 抗磷酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（美国CST公司）. RIPA细胞裂解试剂盒（上海申能生物科技有限公司）. BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（美国Pierce公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进行细胞培养. 标本获取经患者同意. 标本采用无菌收集，保存于4℃无菌KSFM，4 h内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法［3］. 获取的食管上皮细胞于KSFM（无血清培养液，含有BPE和rEGF）中，在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养. 第1次传代培养后进行CK14的免***细胞化学染色鉴定细胞. 实验组细胞于无BPE和rEGF的KSFM中同步化培养48 h后，分别在6种胆酸溶液中培养3~60 min. 以正常培养液中培养的细胞为对照组.
1.2.2细胞增殖分析将细胞接种于96孔板，5×103细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24 h， MTT法检测细胞增殖情况. 在每孔培养液中直接加入10 μL MTT溶液 (5 mg/mL)，4 h后弃去培养液，用100 μL二甲基亚砜裂解细胞. 于490 nm测定吸光值，计算细胞增殖比，增殖比=实验组吸光值/对照组吸光值.
1.2.3细胞周期观察将细胞接种于6孔板，5×105细胞/孔. 胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤一次. 每个样本约106个细胞，加入750 mL/L冷乙醇固定4℃保存. 以50 μg/mL核糖核酸酶和50 μg/mL碘化丙啶染色，流式细胞仪（FACSCalibur型，美国BD公司）观察G1， S和G2相的细胞比率，以及细胞凋亡率.
1.2.4磷酸化ERK1/2蛋白水平的测定采用Western免***印迹法. 细胞经胆酸作用3 min后，依据RIPA试剂盒说明书提取细胞内总蛋白，BCA法检测蛋白浓度. 以50 μg蛋白上样进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V恒压电泳约25 min，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处换120 V恒压电泳约1 h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部. 电转法(110 V，3 h)将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜上，分别与抗磷酸化ERK1/2抗体（1∶1000稀释）、抗ERK1/2抗体（1∶1000稀释）4℃孵育杂交过夜. ECL法检测蛋白条带，X线曝光. 凝胶电泳分析系统定量条带相对灰度，以磷酸化ERK/总ERK比值判断结果.
统计学处理： 每组实验***重复3次. 实验结果以x±s表示. 多组均数比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P
2结果
2.1人正常食管黏膜上皮细胞的生长特性细胞单层贴壁生长，卵圆形. CK14是食管上皮细胞的骨架蛋白，免***细胞化学染色显示第2代细胞均表达CK14.
2.2人正常食管黏膜上皮细胞在胆酸作用下的形态学变化相差显微镜下（×250）观察发现，对于GC， GCDC， TC， TCDC， CA五个实验组，细胞在胆酸作用（3~60 min）前后无明显形态学变化. DCA组当作用时间为3~20 min时，细胞在DCA作用前后无明显形态学变化；当作用时间超过40 min时，部分细胞出现折光性减低、细胞皱缩.
2.3细胞增殖测定测定结果如***1， GC， GCDC， TC， TCDC， CA 五个实验组的增殖比为0.952±0.154~1.344±0.139，增殖比大于1或略小于1，呈增殖趋势. DCA组当作用时间为3~12 min时，增殖比为1.114±0.163~1.346±0.170，大于1呈增殖趋势；当作用时间大于20 min时，增殖比为0.791±0.108~0.431±0.109，小于1呈凋亡趋势.
2.4细胞周期测定检测结果如表1，当胆酸作用时间为3， 12 min时，GC， TC， CA， DCA四个实验组的S期细胞比率高于对照组(P＜0.05)，各组间的凋亡率无明显差异. 当胆酸作用时间为40 min时，GC， TC， CA组的S期细胞比率、凋亡率与对照组相比均无明显差异；但DCA组的S期细胞比率降低，凋亡率明显增加(P＜0.05).
2.5磷酸化ERK1/2的表达如***2所示，当胆酸作用时间为3 min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK1/2表达增加(P＜0.05). GC作用3 min后0， 5， 15， 30 min时分别测定磷酸化ERK1/2表达(***3)，GC作用刚刚结束时磷酸化ERK1/2表达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15 min以后接近对照组水平.
***16种胆酸作用3~60 min对细胞增殖比的影响（略）
表1胆酸作用3， 12， 40 min对S期细胞比率、凋亡率的影响（略）
aP＜0.05 vs对照.
***2胆酸作用3 min对各组ERK表达的影响（略）
***3GC作用后30 min内的ERK表达（略）
3讨论
近年来的研究发现反流性食管炎、Barrett食管均存在细胞增殖提高［4］，就此有学者研究了酸对细胞增殖的影响，发现酸可使体外培养的BE组织［5］和Barrett相关腺癌细胞系(SEG1)的细胞增殖率升高［6］. 随后有研究表明，GCDC的短时间作用（20 min）也对SEG1细胞具有促增殖效应［7］. 这提示反流物可能是通过引起增殖异常导致了食管炎症、肠化、癌变一系列病变的发生. 由于人正常食管上皮细胞的原代培养在很长一段时间内存在问题，既往的报道均局限于病理状态下食管细胞的研究. 我们通过新近建立起来的人正常食管上皮细胞的原代培养技术［3］，第一次报道了胆酸对人正常食管上皮细胞增殖的影响，以进一步探讨反流性疾病的发病机制.
我们将正常食管上皮细胞分别于4种结合胆酸和2种非结合胆酸中培养3~60 min，基于Barrett食管患者的食管抽吸物中的平均胆酸浓度［8］我们选取了250 μmol/L的作用浓度. 结果显示胆酸的短时间作用提高了人正常食管细胞的增殖. 细胞形态的观察发现，GC， GCDC， TC， TCDC， CA五种胆酸作用3~60 min前后细胞无明显形态学变化，但DCA作用时间超过40 min时，细胞出现折光性减低、细胞皱缩的凋亡改变. 细胞增殖测定表明，胆酸的短时间作用（3~12 min）使得24 h的细胞增殖比大于1，随作用时间延长细胞数有所减少，DCA组减少尤为明显，表明DCA较其他五种胆酸对细胞的毒性作用更大. 细胞周期的测定结果进一步证实了上述增殖改变，胆酸作用3， 12 min时S期细胞比率升高，作用40 min时S期细胞比率降低，DCA组降低尤为明显，并伴有凋亡率增加.
上述结果提示胆酸对食管细胞的作用具有一定的时效性，即短时间作用产生促增殖效应，长时间作用引起凋亡改变. 临床上食管内的胆汁反流具有间断性、反复性的特点，因此我们认为胆酸引起的增殖凋亡异常对反流性疾病的发病机制具有重要意义. 既往对胆酸毒性作用的报道很多，相关作用机制的研究也十分广泛深入，但对胆酸诱导增殖的机制报道尚少. 我们从信号转导机制方面研究了ERK通路与胆酸诱导增殖的关系，以进一步探讨胆酸诱导增殖的可能机制.
MAPK通路主要有4条途径，ERK是其中研究得较为彻底的一条通路. ERK在所有的真核细胞中都表达，正常情况下以非活性形式位于胞质，受到理化因素刺激时被激活而转位入胞核，参与了细胞生长、发育、***等生理过程，并在细胞增殖、凋亡、恶性转化等病理过程中起重要作用［2］. 我们发现胆酸诱导正常食管细胞增殖与ERK表达上调有关. 当胆酸作用时间为3 min时，与对照组相比，各实验组的磷酸化ERK 表达增加，胆酸作用刚刚结束时磷酸化ERK达最高水平，随时间延长表达水平逐渐下降，15 min以后接近对照组水平，表明胆酸对正常食管细胞的促增殖作用可能是通过ERK路径.
我们认为，胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关. 由此我们推测胆汁反流可能是通过ERK介导的细胞增殖异常，导致反流性食管炎、Barrett食管乃至腺癌的发生.
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细胞增殖论文篇10
关键词：峨参提取物；肺癌细胞；细胞凋亡
中***分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0060-03
Tentative Study of Anthriscus Extracts Repressing the Proliferation of Lung Cancer Cell A549 and H460
TU Xianqin1，MA Chaoying1，XU Yinsheng1，GAO Yarong1，NIU Shunzi2，TANG Jing1，GENG Yun1，JIANG Hezhong1
(1.Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031，Sichuan,China；
2.Shijiazhuang Pharmaceutical Group NBP Pharmaceutical Co., Ltd.,Shijiazhuang 100036，Hebei，China)
Abstract:Objective:To observe the inhibition of petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and butanol extracts of Anthriscus sylvestris (L.)Hoffm on the proliferation of lung cancer cell A549 and H460.Methods:To detect the inhibition effects of different parts with different concentrations Anthriscus extracts on the proliferation of lung cancer cell A549 and H460 by MTT assay.Result:4 parts of Anthriscus sylvestris extracts have inhibition effect on the proliferation of lung cancer cell A549 and H460 when concentrations are from 10 to 1000μg/mL,moreover,the extracts of petroleum ether, chloroform and ethyl acetate parts have more obvious evident inhibition.Conclusion:The extracts of different parts of Anthriscus have evident inhibition effect on the proliferation of lung cancer cell.
Key words:extracts of Anthriscus;lung cancer cell;Apoptosis
峨参为伞形科植物峨参（Anthriscus sylvestris (L.)Hoffm）的根，是著名的川产道地药材之一，能补中益气，祛瘀消肿，补肺平喘[1]。目前，国内外对该药的研究主要在植物学和化学成分方面，近年来对其药理作用渐有研究，除了其抗炎、抗过敏、抗氧化、活血化瘀等作用外，近期有人从峨参根中提取出去氧鬼臼毒素（即峨参内酯），对人体子宫颈腺癌传代细胞系的作用表明具有显著促进细胞凋亡的作用[2]，但其对肺癌细胞的作用目前尚无文献报道，本文观察了峨参提取物对体外培养肺癌细胞A549和H460增殖的影响。
1实验材料
1.1 细胞 人肺癌细胞株A549和H460购自于四川大学华西国家重点实验室。
1.2 药品与试剂 RPMI-1640和胰蛋白酶均采用Gibco进口分装，MTT购自宝信生物有限公司。峨参饮片购自于四川省峨眉山市仙山中药饮片公司，经本院宋良科副教授鉴定为四川峨眉山产伞形科峨参属植物峨参的干燥块根。其余试剂均采用分析纯。
1.3 主要仪器 CO2恒温孵箱（3110型，美国Thermo公司）、细胞培养板、培养瓶（美国Coster公司）、酶标仪（Elx-800型，美国Bio-Tek公司）、离心机（L420型，长沙湘仪离心机有限公司）、倒置相差显微镜（日本索尼公司）、荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）、超净工作台（BSW-880，江苏苏净集团有限公司）、闪式提取器（JHBE-50型，河南金鼎科技有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
2实验方法
2.1峨参提取物的制备 将峨参切断，粉碎成细小颗粒，过20目筛，烘干，用8倍量80%乙醇浸泡24h，利用闪式提取器，分别间断提取共3min（15000r/min，1800w），抽滤，得到滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏。再用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到各个部位浸膏，使用前用RPMI 1640调整至实验所需浓度，DMSO（浓度
2.2细胞株培养将肺癌细胞A549和H460接种于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基的培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，每2天换液传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
2.3峨参提取物对肺癌细胞A549、H460增殖抑制作用的检测取对数生长期细胞接种于24孔培养板内，每孔2×104个细胞/mL。细胞贴壁后加入峨参的4个部位提取物，共设4个药物浓度梯度，分别为0.1%DMSO、10、100和1000μg/mL，每个浓度3个复孔，每孔体积500μL，培养48h后，每孔加入1mg/mL MTT工作液500μL，37℃放置4h，弃上清，每孔加入500μL 0.4%酸化异丙醇，220r/min摇床震荡5min溶解结晶，充分震荡后，吸取200μL至96孔酶标板于全自动酶标仪检测570nm波长处的各孔吸光度(OD值)，0.1%DMSO作为阴性对照，根据0.1%DMSO值绘制曲线，比较不同部位提取物在不同浓度下对2个细胞株的增殖影响。
细胞增殖抑制率(%)=（1-药物组平均OD值/对照组平均OD值）×100%
2.4统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据分析，各组数据以（±s）表示，实验组及对照组比较用单因素方差分析。
3结 果
3．1峨参各部位提取物对肺癌细胞A549生长的抑制作用 采用MTT法检测峨参提取物对肺癌细胞A549增殖的抑制作用，表1～4结果表明，与对照组相比，不同浓度的不同部位峨参提取物对肺癌细胞A5明显49增殖具有抑制作用（P
3.2峨参各部位提取物对肺癌细胞H460生长的抑制作用 采用MTT法检测峨参提取物对肺癌细胞H460增殖的抑制作用，表5～8结果表明，与对照组相比，不同浓度的不同部位峨参提取物对肺癌细胞H460增殖具有明显抑制作用（P
4讨 论
中药***肿瘤是我国在肿瘤***上的一大特色，由于中药不良反应小而备受关注，本实验中MTT法结果表明，10～1000μg/mL的峨参石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对人肺癌细胞A549和H460都有明显的抑制增殖作用，其中石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物抑制效果更明显，这为峨参抗肿瘤提供了实验依据，值得进一步深入研究。
参考文献