微生物转化技术应用详细介绍

微生物转化技术应用详细介绍

微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基因)进行的催化反应。以下是整理的微生物转化技术应用详细介绍，希望对大家有所帮助。

1.概述

在过去的30多年中，微生物转化或酶转化技术在有机化学合成领域中的尝试不仅使理论研究获得广泛开展，在实际应用方面也取得了长足的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物、食品添加剂、维生素、化妆品和其它一些精细化工产品合成过程中的某些重要反应，目前已经能够用微生物或酶转化技术得以替代。

这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应，因而微生物转化可以认为是有机化学反应中的一个特殊的分支。某种特殊的微生物能够将某种特定的底物转化成为某种特定的产物，其本质是酶的作用。因此，对酶转化无需多作解释，它与微生物转化的差别仅在于：前者是一个单一的酶催化的化学反应，而后者为了实现这一酶催化反应，需要为微生物提供一个能够生物合成这些酶的条件，因此，从这一角度来看，这似乎是真正的生物转化。

另外，尽管用于生物转化的酶大多来自于微生物，但也可以是来自于动物和植物的酶。而对于一个具体的生物转化来说，究竟是采用微生物转化技术，还是采用酶转化技术，这要综合考虑实现这一过程的诸多因素，如成本、环境、技术装备和质量要求等。在研究一个微生物(或酶)转化过程时，需要仔细地考虑诸多方面的问题如：所用转化底物的选择、所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等。其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力。再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。为了寻找能够适合作为生物催化剂的微生物酶，除了有必要对原来已知的一些重要的酶或反应进行重新评价外，一种更为有效的方法是筛选新的微生物菌株或酶。用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性(它们能够修饰和降解许许多多有机化合物)，使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。

2.生物转化与药物开发的应用

愈来愈多的研究表明，作为***用药物的外消旋体混合物有着不可避免的缺点，而美国FDA公布的手性药物指导原则无疑加快了从头开始开发单一异构体药物或利用外消旋体转换技术从已有的药物中开发单一异构体药物的步伐。手性药物制备的关键技术是不对称合成技术。多年来，有机化学工作者已经研究开发了许多种用化学的方法进行不对称合成的技术，但近20多年来，很多长期从事化学合成研究的工作者对微生物和酶反应发生了兴趣，与此同时，很多长期从事微生物和酶的研究的工作者对如何将此应用于有机合成发生了兴趣，从而使生物催化转化成为一种进行不对称合成的重要技术。

应用生物催化转化技术进行不对称合成与化学合成法相比较具有的优越性有：

1)转化底物某一基团的专一性强，即对不需要转化的基团无需保护；

2)通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；

3)生物催化转化的反应条件温和且对环境的污染很小。特别是近年来DNA重组技术的应用和新的转化系统的开发应用，使愈来愈多的原来使用化学方法进行不对称合成的化合物有可能被生物催化转化的方法来替代。

利用生物转化技术进行手性药物的开发主要进行两个方面的工作：一是进行药物关键中间体的制备，因为利用生物催化转化方法制备对映体纯化合物具有很大的吸引力，但试***利用这种方法来完成所期望的复杂的有机合成往往是困难的，甚至是不可能的，而利用这种方法获得某一关键中间体是切实可行的；另外，尽管用化学的方法能够在实验室条件下获得所需要的手性药物，但往往是由于成本和技术问题难以实现产业化。因此用化学生物化学的制备路线具有独特的优越性，即所谓的“绿色合成工艺”；二是进行消旋化合物的生物拆分或转化，得到单一构型的药物分子。

3.组合生物催化与新药发现组合

生物转化(催化)，是指利用一种以上的具有特殊转化功能的微生物或酶，对同一个母体化合物进行组合转化，以得到化学结构的多样性，它是从已知化合物中寻找新型衍生物以及从简单化合物制备复杂化合物的有效手段。从某种角度讲，它比化学合成的方法更为简单和有效。这是一个新的研究领域。天然产物的多样性和其结构的复杂性，是存在于生物体内大量酶的作用结果。生物体内负责一系列重要生命活动的酶，在体外同样具有相同的催化能力。因此，只要体外的催化环境与体内相仿，则能够实现一系列复杂的，特别是用传统化学合成方法难以实现的化学反应。利用生物催化剂或化学合成酶催化相结合的方法，能够大大地增加衍生物的多样性，以及能够有效地对复杂天然产物的结果修饰和从简单的分子构建新的化合物库，在这过程中，往往能够发现新的生理活性物质。生物催化剂为扩大组合化学提供了各种合成的可能性。

利用生物催化发现先导化合物的优越性在于：

1)可能进行反应的范围广；

2)能够定向进行区域选择性和立体选择性；

3)不需基团保护和脱保护，一步实现所需的反应；

4)在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一步反应的重现性；

5)温和的反应条件保证了复杂易变的分子结构的稳定性；

6)高的催化活性可以降低催化剂的用量；

7)酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用；

8)生物催化剂可在环境中完全被降解。

4.近年来一些相关课题的进展

4.1甾体类微生物转化的研究甾体药物包括激素类药物和非激素类药物：前者如性激素、类皮质激素和蛋白同化激素等；后者有抗细菌和抗肿瘤药物等。由于其不可取代的用途及***适应证不断扩大，甾体药物越来越引起人们的重视。利用生物转化技术进行甾体药物生产主要有植物甾醇的边链切除，以得到关键中间体ADD和4AD，以及进行立体选择性的羟化反应。

(1)利用微生物转化切除边链，制备甾体药物关键中间体ADD和4AD微生物对甾体边链的裂解转化是一个很慢的过程，因为底物和产物的溶解性都很差，且底物传递至细胞的过程和产物传出细胞的过程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物转化率的重要步骤。我国在微生物转化菌株的菌种选育、转化条件的优化和转化系统的研究方面进行了数年的研究工作，最终已经获得了具有产业化价值的微生物转化技术，即以天然维生素E生产下脚料(含有混合植物甾醇)为底物制备甾体药物关键中间体ADD和4AD的工业化路线。

(2)利用微生物转化选择性羟基化，制备甾体药物关键中间体11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新药依普利酮关键中间体11OH坎利酮我们分别进行了以ADD、4AD以及坎利酮为底物的微生物转化菌株的筛选、选育，以及转化条件的优化等大量研究工作，最终获得了具有产业化价值的微生物转化制备工艺。

(3)利用微生物转化技术，获得多种4AD结构类似物很多甾体药物的关键中间体与4AD的结构类似物有关，我们筛选了多种具有不同特性的微生物菌株对4AD进行转化，结果得到了一系列的'4AD结构类似物。

(4)利用微生物转化技术，从植物混合甾醇直接生产睾酮在我们多年对植物甾醇微生物转化边链切除的研究过程中，发现了一个非常有意义的现象：即在经过诱变处理的大量微生物转化菌种中，发现了一株能够直接将植物甾醇转化成睾酮的菌株。同时，转化条件的改变能够使睾酮的转化率大大地提高。进一步的研究表明，能够将植物甾醇直接转化成大量睾酮的微生物菌株，其17羰基还原酶的活性比较高，因而将已经转化的ADD和4AD中17位的羰基还原成为羟基，分别获得睾酮和去氢睾酮，以及另外一个17位边链发生改变的结构类似物。经过大量的菌种选育工作和转化条件的优化工作，已经获得了一条利用微生物转化直接从混合植物甾醇制备睾酮的工业化工艺路线。

4.2降糖药物米格列醇的研究开发米格列醇(miglitol)的发现源于对微生物发酵产物野尻霉素的研究，研究显示该原来作为抗沙门氏菌的抗生素具有较强的α葡萄糖苷酶抑制作用，继而成为第一个具有开发价值的淀粉酶抑制剂。1脱氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素还原而得，也可由多种链霉菌和芽孢杆菌产生，同样具有糖苷酶抑制作用。N取代1脱氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的结构与葡萄糖相似，能够可逆地竞争性抑制假单糖α葡糖苷酶，减少单糖的代谢，降低在小肠的吸收。根据文献报道，有多种制备米格列醇的化学合成工艺。其中有以6脱氧6氨基山梨醇为原料，经雷尼镍催化还原后，再与环氧乙烷反应而成。也可以先与环氧乙烷反应后，再在钯碳催化下还原制得。另外，也有多种利用生物转化和化学合成相结合的方法，以及先用微生物发酵制备野尻霉素或1脱氧野尻霉素后再用化学合成的方法来制备米格列醇。本中心研究开发的米格列醇制备工艺采用生物转化与化学合成相结合的方法，简要工艺流程如***7所示。本制备工艺的关键是筛选具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能够实现产业化的转化工艺。

4.3降糖药物伏格列波糖的研究开发伏格列波糖是新一代的α葡糖苷酶抑制剂，最初是从某种放线菌培养液中发现的氨基糖类似物，口服后能竞争拮抗性地抑制肠道内双糖类水解酶(α葡糖苷酶)，延缓糖尿病患者餐后血糖的迅速上升从而抑制餐后高血糖。同时伏格列波糖明显降低身体的脂肪量，肥胖的减轻使胰岛素受体敏感性增加，进而使空腹血糖逐渐明显下降。据文献报道，伏格列波糖的制备除了通过全化学合成获得外，还有以下几条路线：一条路线是由有效霉素产生菌发酵，从发酵液中分离出大组分有效霉素A，经生物转化后得到关键中间体valienamine和validamine，再经过化学合成即可得到终产物；或是从有效霉素发酵液中分离出小组分有效霉素G，生物转化得到关键中间体valienamine和valiolamine，两者经适当步骤的化学合成反应后即可得到终产物；第二条路线是从有效霉素发酵液中分离出小组分valienamine，经化学合成后得到终产物；第三条路线是从有效霉素发酵液中分离出小组分valiolone，同样经适当化学合成反应后得到终产物；第四条路线是由D葡萄糖经一系列的化学反应直接合成得到终产物。

4.4N乙酰神经氨酸的研究开发N乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒药物扎那米韦的前体，其本身也具有多种重要的应用价值。目前有三种不同的生物转化方法制备：途径Ⅰ是一个相对简单的醛缩反应；途径Ⅱ涉及到反应前体ManNAc的磷酸化；途径Ⅲ所合成的产物Neu5Ac9P需要进一步用另外的酶脱磷酸化。这些合成方法均可在体外进行，目前已经用于工业化生产的是途径Ⅰ。

目前易采用途径Ⅰ的生物转化方法，首先从E.coliC600中成功地扩增了N乙酰神经氨酸裂合酶基因(nal)，通过同源性比较发现，它与来源于E.coliK12的nal序列完全一致。氨基酸序列比对结果表明，136和164位的氨基酸也为赖氨酸和酪氨酸，与文献报道的活性中心位点一致。进而，将该基因通过EcoRI和BamHI两个酶切位点，严格控制起始密码子和启动子间距离的情况下克隆到高表达载体pYG5上，构建成新的质粒pLY2，并进行其表达研究。然后对粗酶的制备、转化条件的优化、分析检测方法的建立，以及产物的分离纯化等进行了研究，初步获得了一条适合工业化生产N乙酰神经氨酸的路线。

微生物的指示作用

(1)着生的缘毛目多时，处理效果良好，出水BOD5和浊度低。(如小口钟虫、八钟虫、沟钟虫、褶钟虫、瓶累枝虫、微盘盖虫、独缩虫)这些缘毛目的种类都固定在絮状物上，并随窗之而翻动，其中还夹杂一些爬行的栖纤虫、游仆虫、尖毛虫、卑气管叶虫等，这说明优质而成熟的活性污泥。

(2)小口钟虫在生活污水和工业废水处理很好时往往就是优势菌种。

(3)如果大量鞭毛虫出现，而着生的缘毛目很少时，表明净化作用较差。

(4)大量的自由游泳的纤毛虫出现，指示净化作用不太好，出水浊度上升。

(5)如出现主要有柄纤毛虫，如钟虫、累枝虫、盖虫、轮虫、寡毛类时，则水质澄清良好，出水清澈透明，酚类去除率在90%以上。

(6)根足虫的大量出现，往往是污泥中毒的表现。

(7)如在生活污水处理中，累枝虫的大量出现，则是污泥膨胀、解絮的征兆。

(8)而在印染废水中，累枝虫则作为污泥正常或改善的指示生物。

(9)在石油废水处理中钟虫出现是理想的效果。

(10)过量的轮虫出现，则是污泥要膨胀的预兆。

另在一些对原生动物不宜生长的污泥中，主要看菌胶团的大小用数量来判断处理效果。变形虫（阿米巴）amoeba顾名思义，变形虫是能变形的。不过这种变形也是有限度的。

一些种类的变形虫能向四外伸出假足，以探查水中的化学成分，决定移动方向。而有些种类根本没有假足。

他们猎食时覆盖它的猎物，把猎物裹起来，这样就产生了一个食物泡，食物泡可以消化吸收猎物。

大多数变形虫对人体无害,但有几种变形虫能产生人类疾病：阿米巴痢疾，主要发生在贫穷国家。

微生物的定义

什么是微生物呢？所谓微生物是指个体微小，必须借助于显微镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的微小生物，如细菌。（体型微小，必须借助于光学显微镜或电子显微镜才能看到它们的结构，结构简单，有的具有细胞构造，有的甚至没有细胞构造，生长繁殖快，对物质具有非常强烈的转化作用；容易引起变异，以致微生物的种类特别繁多，并且新的种类还在不断产生；数量多，分布广，对自然环境的适应性强，以致在自然界的任何地方如土壤、空气、水以及人和动植物体上都有微生物生活或生存）

微生物的特点

微生物是结构简单、繁殖快、分布广、个体最小的生物。

1、结构简单：微生物多数是单细胞；

2、生长旺，繁殖快（大肠杆菌在它的适宜37-44℃之间，20-30分钟繁殖一代）

3、分布广、种类多（10万多种）：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等。

4、个体小：小于0.1mm。在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。

5、适应性强，易变异。相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。

6、代谢活性强，转化快。

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