我优求知网革兰氏染色结果的影响因素及原因分析
研究了菌龄、涂片厚度、媒染时间、乙醇脱色程度等对革兰氏染色结果的影响。结果表明，在进行革兰氏染色时，大肠杆菌在营养琼脂培养基上的培养时间不宜超过25小时，以下是为大家整理的革兰氏染色结果的影响因素及原因分析，仅供参考，希望能够帮助大家。
革兰氏染色结果的影响因素及原因分析
革兰氏染色应用(原理，方法，步骤，优缺点)
1. 革兰氏染色液简介：
革兰氏染色是一种差异染色方法，用于根据细菌细胞壁的特性将细菌分为两组（革兰氏阳性和革兰氏阴性）之一。它也被称为革兰氏染色法或革兰氏法。该程序是以发明该技术的丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·格拉姆命名的。
2. 革兰氏染色的工作原理
革兰氏染色方法基于某些细菌细胞壁中肽聚糖之间的反应。革兰氏染色包括给：细菌染色，用染剂固定颜色，使细胞脱色，并进行复染。
a. 结晶紫与肽聚糖结合，将细胞染成紫色。革兰氏阳性细胞和革兰氏阴性细胞的细胞壁中都含有肽聚糖，所以最初，所有细菌都会染成紫色。
b. 碘和碘化钾用作染色剂或固定剂。革兰氏阳性细胞形成结晶紫碘复合物。
c. 用酒精或丙酮使细胞脱色。革兰氏阴性细菌的细胞壁中的肽聚糖要少得多，因此这一步骤基本上使其无色，而革兰氏阳性细胞中只有一些颜色被去除，这些细胞含有更多的肽聚糖（细胞壁的60-90%）。革兰氏阳性细胞的厚细胞壁在脱色步骤中脱水，导致细胞收缩，并将染色碘复合物滞留在细胞内。
4. 脱色步骤后，应用复染（通常是藏红，但有时是紫红色）将细菌染成粉红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都会染上粉红色的污渍，但在革兰氏阳菌的深紫色上看不到。如果正确执行染色程序，革兰氏阳性菌将为紫色，而革兰氏阴性菌将为粉红色。
3. 革兰氏染色技术的目的
用光学显微镜观察革兰氏染色的结果。由于细菌是有色的，因此不仅可以确定它们的革兰氏染色组，还可以观察到它们的形状、大小和聚集模式。这使得革兰氏染色对于医疗诊所或实验室来说是一种有价值的诊断工具。虽然染色可能无法明确识别细菌，但通常知道它们是革兰氏阳性还是革兰氏阴性就足以开有效抗生素的处方。
4. 革兰氏染色技术的缺点
有些细菌可能是gram-variable or gram-indeterminate。然而，即使这些信息也可能有助于缩小细菌的范围。当培养物不到24小时时，该技术最可靠。虽然它可以用于肉汤培养（但最好先离心处理）。该技术的主要局限性是，如果在该技术中出错，则会产生错误的结果。要产生可靠的结果，需要实践经验和技能。此外，传染源可能不是细菌。真核病原体染色为革兰氏阴性。然而，除真菌（包括酵母）外，大多数真核细胞在这个过程中都无法粘附在载玻片上。
5. 革兰氏染色所需材料
※ 结晶紫（主色）
※ 革兰氏碘液（媒介染剂，用于将结晶紫固定在细胞壁中）
※ 乙醇或丙酮（脱色剂）
※ 藏红花（二次染色或复染色）
※ 水壶或滴管瓶中的水
※ 显微镜载玻片
※ 复合显微镜
6. 革兰氏染色步骤
a. 将一小滴细菌样本放在载玻片上。将细菌通过本生灯的火焰加热三次，将细菌固定在载玻片上。加热过多或时间过长会融化细菌细胞壁、扭曲其形状，导致结果不准确。如果加热太少，细菌会在染色过程中从载玻片上洗掉。
b. 用滴管将原色（结晶紫）涂在载玻片上，让其静置1分钟。用不超过5秒钟的水轻轻冲洗载玻片，以去除多余的污渍。冲洗时间过长可能会去除太多颜色，而冲洗时间不够长可能会使革兰阴性细胞上残留太多污渍。
c. 用滴管将革兰氏碘涂在载玻片上，将结晶紫固定在细胞壁上。让它静置1分钟。
d. 用酒精或丙酮冲洗载玻片约3秒钟，然后立即用水轻轻冲洗。革兰氏阴性细胞将失去颜色，而革兰氏阳性细胞将保持紫色或蓝色。然而，如果脱色剂打开时间过长，所有细胞都会失去颜色！
e. 涂上第二层着色剂藏红花，静置1分钟。用水轻轻冲洗，冲洗时间不得超过5秒。革兰氏阴性细胞应染成红色或粉红色，而革兰氏阳性细胞仍将呈现紫色或蓝色。
f. 使用复合显微镜查看幻灯片。可能需要500倍至1000倍的放大倍数来区分电池形状和排列。
影响革兰氏染色结果准确性的关键因素。
1.试剂影响。首先应确保使用的试剂须有效。实验室应当建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存放、使用、过期后的废弃处理都应有严格规定。
2.染色菌的选择。菌龄对革兰氏染色结果的影响是十分大的。染色过程中选择的菌应是处于活跃生长期，这样的细菌活性强，生理特征明显，染色结果准确度高，一般情况下不会出现误差。培养时间较长的革兰氏阳性菌，由于细胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已经死亡或者自行溶解了，造成细胞壁通透性增加，就会呈现出假阴性。
3.涂菌的状态。在染色最初的涂布中，在挑取菌体后应该在无菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布过程中，若是菌体堆积，也会极大影响染色结果的准确性。菌落堆积过多，往往菌体之间变得毫无缝隙，而其细胞壁的成分影响造成了脱色的情况不佳，容易产生假阳性的结果。同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染液覆盖整个菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌没有染色。因此在涂片过程一定要将菌膜涂得少而均匀，这样才能达到最佳效果。
4.媒染时间。媒染时间对革兰氏阴性菌的染色结果有很大影响。由于媒染时间过长，结晶紫在碘液长时间作用下过分牢固结合在菌体细胞壁上，影响了酒精的脱色效果，从而会导致这种假阳性的效果。媒染时间控制在50-60s为宜。
5.酒精脱色。酒精脱色也是一个对结果影响较大的操作过程。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌最主要的差异是细胞壁肽聚糖层厚度和结构，革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层很薄，脂多糖含量高因此在酒精脱色时，细菌细胞壁的多糖成分会被酒精溶解，增大了细胞壁的通透性，结晶紫及碘复合物就很快被酒精洗脱，之后就会被沙黄复染呈红色；而阳性菌肽聚糖层厚，脂多糖少，酒精只能起到脱水效果而无法进入，这样结晶紫和复合物就无法洗脱出来使细胞呈紫色。因此，酒精脱色时间短，脱色效果不佳，会导致阴性菌菌体内的结晶紫和复合物不能有效的全部洗脱出来，就会出现明显的误差，使阴性菌出现假阳性。而洗脱时间过长，也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏，导致细胞内的紫色被洗脱，呈现假阴性。洗脱时间应当严格控制在20s-30s之间，同时保证洗脱效果。
革兰氏染色过程中，在保证试剂有效的前提下，需严格控制的几个方面：
染色菌必须是在其活跃期内，
涂布状态不可太厚，
媒染时间严格控制在50s-60s之间，
脱色时间严格控制在20s-30s。
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